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企業(yè)展示脂質(zhì)體（liposome）是一種人工合成的、具有雙分子層結(jié)構(gòu)的封閉囊泡，由磷脂、膽固醇、PEG等兩性分子自組裝形成。當(dāng)兩性分子分散于水相時(shí)，疏水尾部聚集避開水相，親水頭部暴露在水相，形成獨(dú)特的囊泡結(jié)構(gòu)。正是這種精巧的結(jié)構(gòu)，賦予了脂質(zhì)體藥物靶向遞送、降低毒性、提高穩(wěn)定性、緩釋控釋等獨(dú)特優(yōu)勢。
圖1 脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)
目前，中國已上市多種脂質(zhì)體藥物，包括鹽酸多柔比星脂質(zhì)體注射液、注射用紫杉醇、兩性霉素B脂質(zhì)體、鹽酸伊立替康脂質(zhì)體注射液、鹽酸米托蒽醌脂質(zhì)體注射液等。隨著脂質(zhì)體技術(shù)的不斷成熟，這類“復(fù)雜藥物制劑”的應(yīng)用正在日益廣泛。
1 脂質(zhì)體藥物體內(nèi)存在形態(tài)：為何生物分析如此復(fù)雜？ 脂質(zhì)體藥物進(jìn)入機(jī)體后，并非以單一形態(tài)存在。至少存在三種形態(tài)：脂質(zhì)體包裹的藥物、釋放出的游離藥物和釋放后與血漿蛋白結(jié)合的藥物。對于脂質(zhì)體藥物進(jìn)行藥代/毒代動(dòng)力學(xué)的研究，需要細(xì)致探討不同形式藥物的濃度。 圖2 脂質(zhì)體藥物體內(nèi)存在形態(tài) 這背后的邏輯在于，在血液或正常組織內(nèi)釋放的游離藥物濃度是與不良反應(yīng)程度呈正相關(guān)，而在腫瘤組織等靶器官內(nèi)釋放的游離藥物濃度則與藥效呈正相關(guān)。因此，準(zhǔn)確測定不同形態(tài)的藥物濃度，是評價(jià)脂質(zhì)體藥物藥效和毒性的關(guān)鍵。 更為復(fù)雜的是，脂質(zhì)體的聚合物材料并非惰性物質(zhì)。研究表明，聚合物材料可影響負(fù)載藥物的吸收、分布、代謝、排泄過程，甚至直接影響細(xì)胞色素P450酶的活性。聚乙二醇（PEG）作為脂質(zhì)體的重要組成材料，還會顯著抑制P-糖蛋白的活性，長期使用可能導(dǎo)致腎蓄積毒性。 因此，準(zhǔn)確定量不同形態(tài)的脂質(zhì)體藥物以及載體中的主要成分，對于藥代動(dòng)力學(xué)（PK）和毒代動(dòng)力學(xué)（TK）評估至關(guān)重要。 2 法規(guī)要求：該測什么？ 對于脂質(zhì)體藥物的生物分析，監(jiān)管機(jī)構(gòu)有著明確的要求。 FDA相關(guān)指導(dǎo)原則建議：對于脂質(zhì)體新藥，檢測目標(biāo)應(yīng)為總藥與游離藥物；對于脂質(zhì)體仿制藥，檢測目標(biāo)應(yīng)為游離藥物與脂質(zhì)體包裹藥物。中國CDE于2023年發(fā)布的《脂質(zhì)體藥物非臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》同樣強(qiáng)調(diào)，脂質(zhì)體藥物在進(jìn)入體內(nèi)后，活性成分一般以負(fù)載型藥物（存在于載藥脂質(zhì)體中未被釋放的藥物）和游離型藥物（從載藥脂質(zhì)體中釋放至脂質(zhì)體外的藥物）的形式存在，進(jìn)行生物樣本分析時(shí)需要對二者進(jìn)行有效分離。 3 分析策略：游離型藥物、負(fù)載型藥物與總藥 對于體內(nèi)游離型或負(fù)載型藥物的測定，主要包括直接法與間接法兩種策略： 直接法：分別測定游離型藥物和負(fù)載型藥物，更能準(zhǔn)確體現(xiàn)暴露量； 間接法：測定總藥物濃度和游離型藥物濃度，取二者差值即為負(fù)載型藥物濃度； 為保證測定的準(zhǔn)確性，兩種方法在樣品處理和分離過程中，需確保負(fù)載型藥物、游離型藥物等不同形態(tài)成分的狀態(tài)不發(fā)生變化。 a)游離型藥物的分析 游離型藥物檢測的核心挑戰(zhàn)在于：脂質(zhì)體在儲存及樣品處理過程中的穩(wěn)定性。pH、溫度、共存化合物、滲透壓、凍融次數(shù)等因素均可能影響脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。 目前最常用的方法是固相萃取法（SPE）。將含脂質(zhì)體的血漿樣品上樣到SPE板后，游離藥物被保留在SPE填料上，隨后洗脫后進(jìn)行LC-MS/MS分析。SPE法利用脂質(zhì)體表面親水基團(tuán)極性大、在SPE填料上無保留的特性，而游離藥物極性小、能夠保留在SPE填料上，從而實(shí)現(xiàn)有效分離。 b)負(fù)載型藥物的分析 負(fù)載型藥物的檢測同樣依賴SPE法。上樣后，由于脂質(zhì)體表面的親水基團(tuán)，脂質(zhì)體整體穿過SPE填料。上樣時(shí)即刻收集通過的液體，經(jīng)蛋白沉淀后進(jìn)行LC-MS/MS分析，即可得到負(fù)載型藥物的濃度。 c)總藥的分析 總藥的分析相對直接。在高有機(jī)相或強(qiáng)酸強(qiáng)堿體系下，脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)破碎釋放藥物，通過蛋白沉淀法可同時(shí)提取游離藥物和包裹型藥物，測得總藥物濃度。 圖3 脂質(zhì)體藥物前處理 4 分離方法的選擇 傳統(tǒng)上分離游離型和負(fù)載型藥物較多使用平衡透析、超速離心、超濾和固相萃取（SPE）法，以上4種分析方法在《脂質(zhì)體藥物非臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》的征求意見稿中均有包含；然而，正式稿僅保留了可以做直接法檢測的固相萃取法。 值得注意的是，親脂性和親水性藥物的分析策略有所不同。對于親脂性藥物，通常可以使用前述SPE方式分離；但對于親水性藥物（如，阿糖胞苷、鉑類等），SPE無法通過極性區(qū)分游離型和負(fù)載型藥物，可能需采用其他方式，如，采用超濾法獲取游離藥物，再以離子交換SPE分離負(fù)載藥物。 實(shí)際應(yīng)用中，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌x用合適的方法進(jìn)行分離檢測。下表總結(jié)了各方法的優(yōu)劣勢： 5 生物分析方法建立的關(guān)鍵考量 a)穩(wěn)定性：最核心的挑戰(zhàn) 脂質(zhì)體藥物生物分析的最大挑戰(zhàn)，莫過于控制脂質(zhì)體在樣品處理過程中的穩(wěn)定性。若負(fù)載型藥物提前釋放，將嚴(yán)重干擾游離藥物的準(zhǔn)確測定。 在早期探索性的非臨床研究中，可以在血漿樣品采集后立即處理的方式避免凍融；但臨床研究中樣品采集后往往需要運(yùn)輸至生物分析實(shí)驗(yàn)室檢測，同時(shí)也為了滿足生物分析法規(guī)對于ISR的要求，需要對血漿樣本中添加冷凍保護(hù)劑以防止儲存和處理過程中藥物的泄漏。常用的冷凍保護(hù)劑包括DMSO、甘油、某些聚合物、乙二醇、丙二醇、海藻糖和蔗糖等。冷凍保護(hù)劑的考察方式如下圖所示。 各穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)條件下，負(fù)載型藥物對游離型藥物檢測影響的考察方式，目前法規(guī)未有明確規(guī)定，但該穩(wěn)定性考察策略是脂質(zhì)體分析方法建立的重要和關(guān)鍵內(nèi)容。 圖4 冷凍保護(hù)劑的作用原理和篩選方式 b)基質(zhì)效應(yīng)與回收率 由于脂質(zhì)體給藥后樣本中既包含待測物又有制劑存在，需要特別關(guān)注空白脂質(zhì)體的影響。如有可能，應(yīng)在方法開發(fā)階段，采用含空白脂質(zhì)體的血漿基質(zhì)進(jìn)行選擇性和基質(zhì)效應(yīng)的考察。 c)離心轉(zhuǎn)速的考量 血液樣品采集后需要離心獲得血漿，供后續(xù)的樣品分析。需要考察離心力對含脂質(zhì)體的血液樣品分層和滲漏的影響，通過比較不同離心力下脂質(zhì)體和游離藥物的峰面積差異，選擇合適的離心力進(jìn)行血漿樣本制備。 此外，劇烈的渦旋可能導(dǎo)致脂質(zhì)體滲漏，因此在樣品配制過程中應(yīng)充分考慮脂質(zhì)體制劑的性質(zhì)。 d)載體材料的生物分析 《納米藥物非臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》和《脂質(zhì)體藥物非臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》中都要求，當(dāng)涉及新輔料/新載體材料 時(shí)，應(yīng)研究新輔料/新載體材料的藥代動(dòng)力學(xué)特征。 因此，若脂質(zhì)體的載體材料中含有新組分，也需要納入生物分析范疇。聚乙二醇化脂質(zhì)和陽離子脂質(zhì)等材料均可通過蛋白沉淀或液液萃取進(jìn)行提取。 脂質(zhì)分子的溶解度和殘留問題在定量分析過程中需要特別關(guān)注，溶劑及流動(dòng)相的選擇至關(guān)重要。目前有濟(jì)醫(yī)藥已有研究建立了生物基質(zhì)中可電離脂質(zhì)的LC-MS/MS定量方法。 6 案例分享 案例一：兩性霉素B脂質(zhì)體——分析方法完整驗(yàn)證，直接法檢測負(fù)載型藥物的實(shí)踐 有濟(jì)醫(yī)藥在兩性霉素B脂質(zhì)體的非臨床研究中，建立了檢測總藥物、游離型藥物和負(fù)載型藥物的直接法和間接法生物分析方法。 在方法開發(fā)過程中篩選了合適的冷凍保護(hù)劑，重點(diǎn)優(yōu)化了前處理?xiàng)l件、LC-MS/MS條件和穩(wěn)定性控制策略，并對分析方法進(jìn)行了完整驗(yàn)證，用于檢測大鼠靜脈給藥后的血漿樣品分析。 通過比較直接法和間接法在負(fù)載型藥物檢測中的差異，結(jié)果顯示，兩種方法獲得的PK趨勢大致相當(dāng)，但在消除相末端負(fù)載型藥物濃度較低時(shí)，間接法可能出現(xiàn)BQL（低于定量下限）結(jié)果，導(dǎo)致數(shù)據(jù)偏差。這一發(fā)現(xiàn)提示，在高靈敏度要求的PK研究中，直接法更具優(yōu)勢。具體技術(shù)細(xì)節(jié)可參見我們2025年8月14日的直播內(nèi)容（主題：脂質(zhì)體藥物生物分析策略——直接法和間接法）。 案例二：阿霉素脂質(zhì)體——穩(wěn)定劑護(hù)航下的精準(zhǔn)定量 以阿霉素脂質(zhì)體為研究對象，有濟(jì)醫(yī)藥建立了LC-MS/MS方法檢測比格犬血漿中的游離型、負(fù)載型及總阿霉素進(jìn)行定量分析。該研究將穩(wěn)定劑添加到血漿樣本中，有效防止了儲存和處理過程中藥物的泄漏，為分析流程提供了靈活性。 案例三：四川藥檢的差異化策略——親脂/親水藥物的“量體裁衣” 四川省藥品檢驗(yàn)研究院針對柔紅霉素-阿糖胞苷脂質(zhì)體建立了差異化的生物分析策略： 親脂性柔紅霉素：采用反向吸附SPE——上樣時(shí)分離脂質(zhì)體包封藥物，洗脫時(shí)分離游離藥物； 親水性阿糖胞苷：采用超濾法獲得游離藥物，采用離子交換SPE法在上樣時(shí)分離脂質(zhì)體包封藥物； 總藥物：通過蛋白沉淀及破乳分離后進(jìn)行液質(zhì)聯(lián)用檢測。 這一策略的啟示在于：不同理化性質(zhì)的藥物需要差異化的分離方案，單一方法難以覆蓋所有脂質(zhì)體藥物類型。 7 結(jié)語 脂質(zhì)體藥物憑借其靶向、降低毒性、提高穩(wěn)定性、緩釋控釋等優(yōu)勢，正在腫瘤、抗感染、鎮(zhèn)痛等多個(gè)治療領(lǐng)域發(fā)揮越來越重要的作用。然而，其特殊的體內(nèi)存在形態(tài)和復(fù)雜的組成，給生物分析帶來了獨(dú)特的挑戰(zhàn)。 從游離型藥物、負(fù)載型藥物到總藥，從SPE到超濾，從冷凍保護(hù)劑的選擇到穩(wěn)定性的方法驗(yàn)證策略——每一個(gè)環(huán)節(jié)都需要精心設(shè)計(jì)和嚴(yán)格驗(yàn)證。只有在方法建立過程中充分考慮脂質(zhì)體的特殊性，才能獲得真實(shí)可靠的藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)，為脂質(zhì)體藥物的研發(fā)和申報(bào)提供堅(jiān)實(shí)支撐。 隨著監(jiān)管要求的日益明確和分析技術(shù)的不斷進(jìn)步，脂質(zhì)體藥物的生物分析正從“經(jīng)驗(yàn)驅(qū)動(dòng)”走向“科學(xué)驅(qū)動(dòng)”。這一領(lǐng)域的持續(xù)創(chuàng)新將為更多脂質(zhì)體藥物的成功上市保駕護(hù)航，最終造福廣大患者。 有濟(jì)醫(yī)藥擁有完整的脂質(zhì)體藥物生物分析平臺，在SPE法、超濾法等分離技術(shù)上積累了豐富的實(shí)戰(zhàn)經(jīng)驗(yàn)，已支持多個(gè)脂質(zhì)體藥物的臨床前及臨床生物分析工作。無論是游離型藥物、負(fù)載型藥物還是聚乙二醇化脂質(zhì)、陽離子脂質(zhì)等新載體材料的定量分析，我們均可根據(jù)項(xiàng)目特點(diǎn)制定合理的分析策略，提供從方法開發(fā)到樣品分析的一站式解決方案。 參考文獻(xiàn) [1] Artificial Cells, Nanomedicine, And Biotechnology, 2017 Doi:10.1080/21691401.2017.1290647 [2] Arzneimittelforschung, 2009;59(9):461–470 [3] Liposome Drug Products: Chemistry, Manufacturing, and Controls; Human Pharmacokinetics and Bioavailability; and Labeling Documentation, 2018, FDA [4] 脂質(zhì)體藥物非臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則，2023，NMPA CDE [5] Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 12487; Doi: 10.3390/ijms232012487 [6] 脂質(zhì)體藥物生物樣品分析的挑戰(zhàn)，2024，晶易醫(yī)藥 [7] 納米藥物非臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行），2021，NMPA CDE [8] 四川藥檢：脂質(zhì)體藥物檢驗(yàn)檢測技術(shù)分享 [9] A convenient and rapid LC-MS/MS method for determination of free and liposomal amphotericin B in human plasma, 2025, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis
