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企業(yè)展示血栓性疾病是全球范圍內(nèi)致死和致殘的首要原因之一。從動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂引發(fā)的急性心肌梗死與腦梗死，到深靜脈血栓脫落所致的肺栓塞，抗血栓新藥的研發(fā)存在大量未被滿足的臨床需求。以凝血因子X(jué)I（FXI）為靶點(diǎn)的下一代抗凝藥物是當(dāng)前研發(fā)最為集中的方向，雖然尚無(wú)FXI/FXIa抑制劑獲批上市，但已有小分子、單抗、小核酸（ASO/siRNA）等多種藥物類型進(jìn)入臨床開(kāi)發(fā)階段。 在抗血栓新藥的臨床前評(píng)價(jià)中，一個(gè)具有重要科學(xué)價(jià)值卻常被忽視的問(wèn)題在于：即便采用相同的損傷誘導(dǎo)方式，不同血管床的血流動(dòng)力學(xué)差異也會(huì)導(dǎo)致血栓形成特征的顯著分化。以頸動(dòng)脈與下腔靜脈為例，前者處于高剪切力、高流速環(huán)境，后者則為低剪切力、低流速環(huán)境，即使在同等FeCl?損傷條件下，兩者的血栓形成動(dòng)力學(xué)亦呈現(xiàn)明顯差異。 有濟(jì)醫(yī)藥體內(nèi)藥理平臺(tái)依托F11基因人源化小鼠，平行建立頸動(dòng)脈及下腔靜脈FeCl?誘導(dǎo)血栓模型，通過(guò)40分鐘連續(xù)血流監(jiān)測(cè)、活化部分凝血活酶時(shí)間（APTT）測(cè)定及人F11蛋白含量檢測(cè)，構(gòu)建了一套集血流保護(hù)效應(yīng)評(píng)估與靶點(diǎn)驗(yàn)證于一體的綜合評(píng)價(jià)體系，為抗栓候選分子的篩選提供堅(jiān)實(shí)的數(shù)據(jù)支撐。
1 模型構(gòu)建 常規(guī)小鼠的F11蛋白在氨基酸序列及三維結(jié)構(gòu)上與人F11蛋白存在差異，可能導(dǎo)致候選分子（尤其是單克隆抗體或小分子抑制劑）在親和力、選擇性及藥效評(píng)價(jià)中出現(xiàn)偏差。F11人源化小鼠通過(guò)將內(nèi)源性小鼠F11基因替換為人源F11基因，表達(dá)人F11蛋白，使臨床前藥效評(píng)價(jià)在“人源靶點(diǎn)”背景下開(kāi)展，有效提升數(shù)據(jù)的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)價(jià)值。 頸動(dòng)脈和下腔靜脈FeCl?兩模型采用一致的誘導(dǎo)策略，即局部貼覆FeCl?損傷血管內(nèi)皮，激活血小板黏附、聚集及凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)。兩者的差異在于誘導(dǎo)部位——頸動(dòng)脈FeCl?模型：高剪切力、血流速度快，模擬動(dòng)脈系統(tǒng)血栓形成環(huán)境；下腔靜脈FeCl?模型：低剪切力、血流速度慢，模擬靜脈系統(tǒng)血栓形成環(huán)境。三項(xiàng)核心指標(biāo)——血流曲線：藥效的可視化直接反映；APTT：內(nèi)源性凝血通路功能的安全窗口評(píng)估；F11蛋白含量：人源化靶點(diǎn)的分子水平驗(yàn)證。 2 評(píng)價(jià)指標(biāo)體系 1.血流曲線：40分鐘內(nèi)兩條血管的閉塞動(dòng)態(tài) 在頸動(dòng)脈模型中，麻醉狀態(tài)下暴露F11小鼠頸動(dòng)脈，局部貼覆FeCl?浸潤(rùn)濾紙片，孵育設(shè)定時(shí)間；下腔靜脈模型則于暴露下腔靜脈后同法貼覆FeCl?濾紙片進(jìn)行誘導(dǎo)。兩組實(shí)驗(yàn)均采用生理信號(hào)記錄系統(tǒng)連續(xù)監(jiān)測(cè)血流達(dá)40分鐘，實(shí)時(shí)記錄血管閉塞全過(guò)程的血流變化。血流曲線作為血栓模型中最直觀的終點(diǎn)指標(biāo)，無(wú)需依賴間接推算，即可直接反映血流速度隨時(shí)間的變化趨勢(shì)。 頸動(dòng)脈FeCl?模型： 模型對(duì)照組于FeCl?孵育后血流迅速下降，約12分鐘時(shí)出現(xiàn)首次閉塞信號(hào)，血流曲線呈陡峭下降，40分鐘內(nèi)多表現(xiàn)為持續(xù)低灌注或完全閉塞。陽(yáng)性藥組血流曲線相對(duì)平穩(wěn)，閉塞出現(xiàn)時(shí)間顯著延遲，40分鐘時(shí)仍維持較高比例的血流通暢率。見(jiàn)下圖1。 圖1 頸動(dòng)脈血流速度 下腔靜脈FeCl?模型： 模型對(duì)照組同樣表現(xiàn)為血流快速下降，但其閉塞進(jìn)程與頸動(dòng)脈模型在時(shí)間特征上存在差異。陽(yáng)性藥組血流曲線趨于平穩(wěn)，閉塞時(shí)間明顯延后，40分鐘時(shí)仍保持較好的血流通暢率。見(jiàn)下圖2。 圖2 下腔靜脈血流速度 將兩條血管的血流曲線進(jìn)行對(duì)比分析，可回答一項(xiàng)關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題：候選分子在動(dòng)脈與靜脈不同血流環(huán)境下是否呈現(xiàn)一致的保護(hù)效應(yīng)。 2.APTT：凝血功能的單指標(biāo)透視 APTT作為內(nèi)源性凝血通路功能狀態(tài)的代表性指標(biāo)，在以F11為靶點(diǎn)的藥物評(píng)價(jià)中具有關(guān)鍵價(jià)值。實(shí)驗(yàn)于血流監(jiān)測(cè)結(jié)束后采血，在試驗(yàn)期間同步測(cè)定APTT（圖3）。見(jiàn)下圖3。 圖3 頸動(dòng)脈（A）及下腔靜脈（B）血栓小鼠APTT 結(jié)果顯示，與模型對(duì)照組相比，給藥組在頸動(dòng)脈及下腔靜脈血栓模型中均表現(xiàn)出APTT顯著延長(zhǎng)，提示藥物對(duì)內(nèi)源性凝血通路的有效干預(yù)。 3.F11蛋白含量 本案例的獨(dú)特之處在于納入了人F11蛋白含量檢測(cè)，此為F11人源化小鼠獨(dú)有的分子終點(diǎn)，可直接測(cè)定人F11蛋白的表達(dá)水平（圖4）。見(jiàn)下圖4。 圖4 頸動(dòng)脈（A）及下腔靜脈（B）血栓小鼠凝血因子水平 結(jié)果顯示，與模型對(duì)照組相比，給藥后頸動(dòng)脈及下腔靜脈血栓模型小鼠的F11蛋白含量均顯著降低。該檢測(cè)可用于監(jiān)測(cè)藥物對(duì)靶點(diǎn)表達(dá)的影響，評(píng)估候選分子或陽(yáng)性藥干預(yù)后人F11蛋白含量的變化。若蛋白含量下調(diào)，則提示藥物的抗栓作用可能通過(guò)降低F11表達(dá)水平實(shí)現(xiàn)。 3 結(jié)語(yǔ) 有濟(jì)醫(yī)藥深耕腦血管疾病領(lǐng)域，搭建起成熟多元的腦血管藥效研究平臺(tái)，已順利完成40余項(xiàng)篩選類藥效學(xué)研究與19項(xiàng)申報(bào)類藥效學(xué)研究，助力多項(xiàng)創(chuàng)新療法取得臨床批件。未來(lái)，有濟(jì)醫(yī)藥將繼續(xù)打造兼具科學(xué)性與臨床轉(zhuǎn)化價(jià)值的評(píng)價(jià)平臺(tái)，推動(dòng)更多腦血管新藥突破臨床前研究瓶頸，早日造福廣大患者。
